【技术分享】药店如何快速有效地分离和鉴定细菌

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药店如何快速有效地分离和鉴定细菌

朱单

       在广袤无垠的自然界中，细菌占据着举足轻重的地位。部分细菌对水产动物有益，并积极参与水产养殖环境中的物质循环。然而，自然界中也存在许多对水产动物有害的细菌，如弧菌、气单胞菌、爱德华氏菌和链球菌等，会给水产动物带来严重的疾病。若不能及时准确地分离和鉴定细菌，将耽误治疗的最佳时期。水产药店可通过观察菌落形态、生长状态和革兰氏染色等，结合发病动物的临床症状，对部分细菌做出快速鉴定。
       一、选择合适的培养基
       利洋公司目前提供硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（TCBS）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）和脑心浸液琼脂培养基（BHI），这三种培养基能为大多数细菌提供生长所需营养成分，可用于初步分离水产动物中的多种细菌。根据不同细菌适合的营养成分选择合适培养基，BHI培养基营养丰富，可用于培养对营养选择性较高的链球菌；TCBS培养基中含特定成分可抑制其它细菌生长，可用于培养弧菌；TSA培养基可培养如气单胞菌和爱德华菌等对营养要求不高的细菌。

图1  三种不同种类的培养基

       二、选择合适的部位
       针对不同水产动物选择合适的采样部位。例如，对于鱼类，可接种肝脏、脾脏、肾脏和脑等；对于虾类和蟹类，可接种肝胰腺、肌肉等；对于贝类，可接种外套膜、消化腺等。不同种类的细菌感染部位有一定的差别，如链球菌和爱德华氏菌能在脑部分离到细菌。
       三、接种方法
       细菌接种方法有多种，最常见的是平板划线法和涂布法。但涂布法容易分离出杂菌，很难分离出单个菌落，所以最常用的是平板划线法。
       平板划线法：用无菌接种环蘸取适量预处理后的样品，在平板培养基表面进行划线接种。划线方式有连续划线、分区划线等，目的是使样品中的细菌分散，经过培养后形成单个菌落。

图2  细菌分离划线方法
（左：分区划线法；右：连续划线法）

       四、培养条件
       根据目标细菌的特性设置合适的培养条件。大多数水产动物致病菌适宜在28℃培养，培养时间一般为18～24小时，但有些细菌可能需要更长时间，如诺卡氏菌，一般要培养7天左右；链球菌喜高温，30℃以上培养生长速度更快。
       五、菌落观察
       培养后，观察平板上生长的菌落形态，包括菌落大小、形状、颜色、边缘、表面质地等特征。不同细菌形成的菌落具有各自独特的形态，通过观察菌落形态可初步判断细菌的种类。例如，气单胞菌在普通营养琼脂平板上，菌落通常呈淡黄色、隆起、馒头状；爱德华氏菌在普通营养琼脂平板上，菌落一般较小，呈半透明、湿润、灰白色；弧菌在TCBS培养基上呈绿色、黄色、黄绿色菌落，在TSA上多数呈半透明、湿润、圆形的菌落。
       六、革兰氏染色
       革兰氏染色是用于细菌分类和鉴定的重要染色方法。它基于细菌细胞壁结构和成分的差异，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏染色的步骤如下：
       1、涂片：取洁净载玻片，在中央滴一小滴生理盐水，用接种环挑取少量细菌，在生理盐水中涂片，干燥固定。
       2、初染：滴加结晶紫染液，覆盖涂片，染色1分钟，水洗，晾干。
       3、媒染：滴加碘液，覆盖涂片，作用1分钟，水洗，晾干。
       4、脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20～30秒，水洗，晾干。
       5、复染：滴加番红染液，染色1～2分钟，水洗，晾干。
       6、镜检：干燥后，油镜观察。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
       不同细菌形态不同，如弧菌呈短杆状，一般有直杆和弯曲形态；链球菌呈球状，短链状排列；乳球菌呈椭圆形、小短杆、圆形，成双或短链状排列。药店工作人员可以结合菌落形态、生长状态和革兰氏染色及时鉴定出部分常见细菌，及时给养殖朋友们提供合适的治疗方案。
       七、注意事项
       1、在整个采样过程中要严格遵守无菌操作原则，采样工具如解剖刀、解剖剪、镊子等需提前进行高压灭菌处理，采样人员戴无菌手套，在无菌环境（如超净工作台）或对采样部位进行严格消毒后进行采样，以避免样品被外界杂菌污染。
       2、酒精脱色是关键步骤，脱色时间要严格控制，一般20～30秒，脱色过度会使革兰氏阳性菌被误判为阴性，脱色不足则革兰氏阴性菌可能被误判为阳性。
       3、结晶紫染色时间不宜过长或过短，一般1分钟左右为宜，时间过长可能导致非革兰氏阳性菌也过度着色，时间过短则革兰氏阳性菌染色不足。
       4、不能确定的细菌，及时送回利洋公司研究所，时间过长，细菌会死亡。
       5、高温天气药店寄回平板，快递中加入冰袋，以防平板长杂菌。

（转自“利洋水产”微信平台）

刚子

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